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　　摘要  以1,2苯并3,4二氫咔唑9乙基苯磺酸酯為衍生化試劑, 在充氮的氣氛下對魚油進行皂化處理, 所得皂化產物經正己烷萃取處理后進行柱前衍生化, 再以HPLC/MS分離和鑒定。通過對長鏈脂肪酸分子的標記處理, 其衍生物分子在質譜分析中呈現出雙鍵位置的規范信息。通過建立模型計算式, 借助不飽和脂肪酸的分子離子峰和特征碎片離子峰的質量數, 計算不飽和的碳碳雙鍵位置。共鑒定出23種脂肪酸。結果表明: 深海魚油主要由C12C22的脂肪酸組成, 多不飽和脂肪酸含量占67.08% (峰面積百分比,下同), 其中C16∶19十六碳烯酸 (11.7%); C16∶44, 7, 10, 13十六碳四烯酸 (2.91%); C18∶112十八碳烯酸 (11.1%); C18∶46, 9, 12, 15十八碳四烯酸 (3.62%); C20∶113二十碳烯酸 (1.21%); C20∶55, 8, 11, 14, 17二十碳五烯酸 (16.71%); C22∶62, 5, 8, 11, 14, 17二十二碳六烯酸 (10.53%)。所建立的方法為不飽和脂肪酸碳鏈中雙鍵位置的確定提供了新的技術手段。

　　關鍵詞  高效液相色譜質譜, 柱前衍生, 魚油, 脂肪酸, 雙鍵位置

　　1  引言

　　多余肌肉酸普遍區域于生態界中，是生物技術性工程技術性體內主要的營養價值和代謝率乙酰乙酸，互換節生物技術性工程技術性體內各種相關生理性性和生物技術性工程技術性實用技能起著主要效果。特別的多不趨于穩定多余肌肉酸的格局顯著特點與生理性性實用技能的各種相關備受矚目。油污中多余肌肉酸的GC/EIMS了解常利用甲酯或三級甲等醫院基硅烷化，但該法不可選定多不趨于穩定多余肌肉酸中碳碳雙鍵的位址，這是因為在電子器材轟擊下，雙鍵沿多余肌肉酸鏈顯眼變更[1～3]。本實驗設計依據柱前繁衍以色譜儀色譜/質譜（LC/MS/APCI）研究探討皂化后的大海中魚油中多余肌肉酸的構成的，用1,2苯并3,4二氫咔唑9乙基苯磺酸酯 (BDEBS)作多余肌肉酸的柱前繁衍化學工業試劑[4,5]，利用軟陰陽離子化論文檢測服務性(大氣層壓化學工業電離源，APCI) 解密了多余肌肉酸繁衍物技術性工程技術性的各種相關質譜信息，選定了大海中魚油中多不趨于穩定多余肌肉酸的碳碳雙鍵的位址。所組建的措施可望在醫療器械、肉食品、人身安全科學研究等行業領域賺取普遍應該用。

　　2  實驗部分

　　2.1  機器設備與物理上的化學藥品Agilent1100型高效能色譜儀色譜質譜聯用儀(Agilent平臺)，配發四元均值泵、100位會自動進樣器、熒光加測器和高清在線正空脫氣機；Agilent 1100 Series LC/MSD Trap，配發豪邁壓物理上的電離源 (APCI)。1,2苯并3,4二氫咔唑9乙基苯磺酸酯(制作方法，見論文資料[4,5])；長鏈呈現飽和狀態狀態及不呈現飽和狀態狀態蛋白質酸標試樣(Sigma平臺)；無水乙腈 (禹城物理上的物理上的化學藥品廠)用P2O5干后水蒸氣蒸餾加工,主要用于配制緩沖區飽和溶液的甲酸、氨水等均為分折純。純凈水由MilliQ超純凈水裝置配制。

　　2.2  規格相轉移催化劑的配好的涼茶合理稱取一定量皮下碳水化合物酸標品，用光譜圖儀純乙腈配制出1.0×10-2  mol/L的相轉移催化劑（長鏈皮下碳水化合物酸需要加入幾瓶DMF有所作為助相轉移催化劑）。稱取0.0404 g的1,2苯并3,4二氫咔唑9乙基苯磺酸酯用DMF定容至10 mL，質量有機廢氣濃度值為5.0×10-2 mol/L。相對應的低質量有機廢氣濃度值的衍生品生化試劑(5.0×10-3 mol/L)及低質量有機廢氣濃度值皮下碳水化合物酸(1.0×10-4 mol/L)的規格相轉移催化劑各是用DMF和光譜圖儀純乙腈配制而成。

　　2.3  深海圖片中魚油的皂化和具象化 魚油皂化決定性學術論文[6]。取100 mg 深海圖片中魚油于具塞試管內，注入1.0 mL 2 mol/L KOH的酒精氫氧化鈉飽和懸濁液，充氮密封帶后，在100℃水浴響應遲鈍0.5 h，卸下來放涼至空調溫度。滴入2.0 mol/L HCl至pH 2.0,注入500 μL正己烷多普勒彩超治療2 min，禁止分段，用接種器吸掉水層后，用去化合物用水洗滌至pH 7.0。N2烘干，的殘留物物再降解在500 μL的乙腈中。向盛有10 mg無水K2CO3崔化劑的2 mL安培瓶中分別注入180 μL DMF，50 μL混合式人體脂肪酸的提現樣，120 μL具象化微生物培養基氫氧化鈉飽和懸濁液(5.0×10-3 mol/L)，粘口后于85℃恒溫器水浴下自由振蕩響應遲鈍45 min，卸下來放冷后, 注入1000 μL乙腈水氫氧化鈉飽和懸濁液（CH3CN/H2O,1∶1, Ｖ/Ｖ）稀釋液后進樣10 μL淺析。具象化響應遲鈍簡況下圖1一樣。

　　2.4  色譜與質譜環境Hypersil BDS C18鋁離子交換柱(4.6 mm×200 mm，5  μm，沈陽市依利特單位)。國內流量相A: 50％乙腈水飽和溶液內涵30 mmol/L的甲酸/氨水緩沖區液 (pH3.5)；B: 100％的乙腈。梯度方向環境：40 min由A到B (B保持穩定10 min),風速為1.0 mL/min, 進樣量為10 μL，柱溫30℃。熒光激起和導彈發射激發光譜依次為333和390 nm。臭氧層壓化學上的電離源（APCI）：正鋁離子檢驗模式切換，噴霧器阻力60 p.s.i (1p.s.i=6894.76 Pa)，空氣干澡氣國內流量為5 L/min，空氣干澡氣高溫350℃，循環流化床高溫450℃，孔隙管交流電壓3500 V，電暈電壓電流4000 nA（Pos）[5,6]。

　　圖1  1,2苯并3,4二氫咔唑9乙基苯磺酸酯與5,8,11,14,172碳五烯酸的誕生情況及質譜損傷經濟模式(略)

　　Fig.1  Ｓcheme of derivatization procedure using 1,2benzo3,4dihydrocarbazole9ethylbenzenesulfonate (BDEBS) as labeling reagent; and the profile of collisioninduced dissociation of representative derivative of 5, 8, 11, 14, 17eicosapentaenoic acid (C20∶5)

　　2.5  本體論組成部分（雙鍵地方判斷）通過質譜了解相應擁有的ip產業物大分子結構所各自的大分子結構陰陽離子峰的效率數[MH]+（圖1圖甲中），可推出了關系式 (1)～(7)，并由此可見設定長鏈過剩及不過剩油脂多酸的碳原子團金額n。過剩油脂多酸：

　　Cn∶0     MH+-1=278+CnH2n-1;      n=(MH+-278)/14(1)不過飽和乳酸酸：

　　Cn∶1    MH+-1=278+CnH2n-3;        n=(MH+-276)/14(2)

　　Cn∶2    MH+-1=278 + CnH2n-5;    n=(MH+-274)/14   (3)

　　Cn∶3    MH+-1 = 278 + CnH2n-7;  n=(MH+-272)/14(4)

　　Cn∶4    MH+-1 = 278+CnH2n-9;  n=(MH+-270)/14(5)

　　Cn∶5    MH+-1 = 278 + CnH2n-11;  n=(MH+-268)/14(6)

　　Cn∶6    MH+-1 = 278 + CnH2n-13;  n=(MH+-266)/14(7)

　　公式換算中n為是處于飽合狀態及不是處于飽合狀態多余蛋白質多酸的碳水氧原子核條數；278為微生物培養基氧原子核母核形式有些的氧原子核量；MH+ 為質譜確實的是處于飽合狀態及不是處于飽合狀態多余蛋白質多酸的氧原子核陰陽陰鐵離子峰的安全性能數。法律依據氧原子核中雙鍵的斷了模試見圖2。有質譜具體分析里面收獲的不是處于飽合狀態多余蛋白質多酸研究物的癥狀英文魂晶陰陽陰鐵離子的安全性能數（雙鍵斷了后帶來的癥狀英文魂晶陰陽陰鐵離子），含1～6個碳碳雙鍵的多余蛋白質多酸鏈中。

　　圖2  脂肪含量酸研究物中的碳碳雙鍵的質譜裂解表示圖(db: 雙鍵; CaH2a:尾部雙鍵斷開所不見的小原子核; CbH2b-2:尾部其次個雙鍵斷開后不見的小原子核)(略)

　　Fig.2  MS cleavage profile of collisioninduced dissociation of fatty acid derivative (db: double bond; CaH2a: losing of small molecule with the cleavage of double bond at the end of molecular carbon chain)

　　的雙鍵地方可由下面關系式 (8)～(13)計算方式刷快：

　　Cn∶1    Cdb= (M+1-276)/14                                                (8)

　　Cn∶2    Cdb1 = (M+2-276)/14;  Cdb2 = (M+1-274)/14(9)

　　Cn∶3    Cdb1 = (M+3-276)/14;  Cdb2 = (M+2-274)/14;  Cdb3 = (M+1-272)/14(10)

　　Cn∶4    Cdb1= (M+4-276)/14;  Cdb2 = (M+3-274)/14; Cdb3 = (M+2-272)/14;

　　Cdb4 = (M+1-270)/14(11)

　　Cn∶5    Cdb1 = (M+5-276)/14;  Cdb2 = (M+4-274)/14;

　　Cdb3 = (M+3-272) /14; Cdb4 = (M+2-270)/14;  Cdb5 = (M+1-268)/14(12)

　　Cn∶6    Cdb1 = (M+6-276)/14;  Cdb2 = (M+5-274)/14; Cdb3 = (M+4-272)/14;

　　Cdb4 = (M+3-270)/14;  Cdb5 = (M+2-268)/14;  Cdb6 = (M+1-266)/14(13)

　　公式計算中的 “dbx”; x = 1, 2,…6 象征著雙鍵在乳酸酸碳鏈中的職位，M＋1到 M＋6是雙鍵斷開后引發的特點英雄勾玉正陰陽離子峰的效率數，實驗性中牽涉到的長鏈乳酸酸的雙鍵極大數額為6， 即 x≤6；且有：M＋1＞M+2＞M+3＞M+４＞M＋5＞M+6; 對互相包含的若干雙鍵乳酸酸的衍生品物，質譜上所提升的特點英雄勾玉正陰陽離子應具備著M＋1－ M+2＝M＋2－M＋3＝M＋3－M+4＝M+4－M+5＝M+5－M+6＝40個效率企業，參看圖1和圖2。

　　3  結果與討論

　　3.1  質譜解密質譜數據統計闡明，所有乳酸酸具象化物物情況出高的原子核機構鋁陰正鐵鐵亞鐵鋁離子峰，其產品數為m/z [MH]+；原子核機構鋁陰正鐵鐵亞鐵鋁離子磕碰裂解后導致的m/z 263.7和 245.7泥石峰為具象化物采血管原子核機構的母核機構的特殊性描述峰（見圖1）。飽滿乳酸酸具象化物物，以C14試對（見圖3）：原子核機構鋁陰正鐵鐵亞鐵鋁離子峰 為474.1，母核機構的特殊性描述泥石鋁陰正鐵鐵亞鐵鋁離子為m/z 263.7和245.7，質譜圖里呈現的泥石峰相對來說容易。含某個碳碳雙鍵的不飽滿乳酸酸具象化物物，以C18∶1試對（見圖4）：原子核機構鋁陰正鐵鐵亞鐵鋁離子峰 為m/z 528.1；失水鋁陰正鐵鐵亞鐵鋁離子峰m/z [MH]+-H2O (m/z 510.0)，情況出的特殊性描述泥石鋁陰正鐵鐵亞鐵鋁離子峰M+1，m/z 值在444.1，相應與之接壤并相距太大1兩人產品企業企業企業單位的特殊性描述峰m/z 456.1。與m/z 444.1相距太大1～2兩人產品企業企業企業單位的泥石峰m/z 442.6 應權包括m/z 444.1的峰。前提等式 (8)，求算出被裂解雙鍵的首碳選址為 12 (Cdb=12)。是因為其高產品端與之接壤的峰為m/z 456.1，剛好相距太大 12 產品企業企業企業單位，它應權包括 C12 = C13 的裂解。

　　圖3  表達性的是處于飽和狀態十四酸(C14∶0) 的質譜慨況圖 (A: MS具體深入分析; B: MS/MS具體深入分析)(略)

　　Fig.3  Ｐrofile of ion current chromatogram and scanning of the isolated representative derivative of saturated tetradecanoic acid (C14, fatty acid) derivatized with BDEＢＳ as labeling agent

　　圖4  以12 18碳稀酸為代表會的單不飽滿脂質酸并衍生物的質譜裂解圖示圖 (A: MS; B和C為MS/MS)(略)

　　Fig.4  Ｐrofile of ion current chromatogram and scanning of the isolated representative derivative of monounsaturated 12octadecenoic acid (C18∶1, fatty acid) derivatized with BDETS as labeling reagent

　　含二個碳碳雙鍵的不飽滿狀態狀態蛋白質的酸行成物，以C20∶5試對 （見圖5）：氧碳共價鍵陽鐵化合物峰 為MH+, m/z 5481；失水陽鐵化合物峰MH+-H2O (m/z 529.9)， 突出表演出的特色描述皮膚靈魂濃縮的魔能石陽鐵化合物峰M+1, m/z 506.1；M+2，m/z 466; M+3, m/z 425.7 (≈426); M+4, m/z 385.8 (≈386); M+5, m/z 346。這特色描述皮膚靈魂濃縮的魔能石陽鐵化合物在其交界的高品產品質理端都一 個與之交界的并差別太大1一款產品質理政府部門的特色描述皮膚靈魂濃縮的魔能石峰，想一想的產品質理數都為m/z 517.9 (≈518); m/z 478; m/z 438; m/z 398.8 (≈400) 和m/z 358。標準等式 (6) 和 (12), 核算出被裂解雙鍵的首碳地方都為17(Cdb1=17)、14(Cdb2=14、11(Cdb3=11)、8(Cdb4=8)和5(Cdb5=5), 所只能根據的被裂解的雙鍵地方都為C17C18、C14C15、C11C12、C8C9和C5C6 (斷了方式見圖1)。剖析統計資料體現 , 飽滿狀態狀態蛋白質的酸行成物的質譜相對比較來說輕松, 不飽滿狀態狀態蛋白質的酸隨雙鍵數額的加大, 質譜裂解皮膚靈魂濃縮的魔能石急劇更復雜, 本科學試驗狀況下, 飽滿狀態狀態蛋白質的酸行成物大多數并沒有損失水氧碳共價鍵峰，僅突出表演出 [MH]+ 和行成化學制劑母核氧碳共價鍵的特色描述峰m/z 263.7和245.7; 而不飽滿狀態狀態蛋白質的酸行成物體現 出專用的失水皮膚靈魂濃縮的魔能石峰[MH]+-H2O 和特色描述皮膚靈魂濃縮的魔能石陽鐵化合物峰M＋1, M＋2…M＋n（其特色描述峰的總數重點有雙鍵的數額影響）。另外，對多不飽滿狀態狀態蛋白質的酸們來說，另個為本要性的特色描述是大多數特色描述皮膚靈魂濃縮的魔能石陽鐵化合物峰M＋1, M＋2……M＋n，想一想能夠 相互間有40個產品質理政府部門的對比分析，即交界的一款雙鍵相互間差別太大個CHCHCH2的機構摸塊（見圖2）。這關于來知道多不飽滿狀態狀態蛋白質的酸雙鍵地方時，追尋質譜圖里所體現 的特色描述皮膚靈魂濃縮的魔能石陽鐵化合物峰M＋1, M＋2……M＋n起著至關為本要的的功效。它將的指導對特色描述皮膚靈魂濃縮的魔能石陽鐵化合物峰的合理來知道（時常這特色描述皮膚靈魂濃縮的魔能石陽鐵化合物峰的峰度相對比較來說較低，又也許與一些皮膚靈魂濃縮的魔能石峰交界，合理來知道存在著有一定困難）。對個是完全不同的酚類化合物們來說，最先由質譜知道只能根據氧碳共價鍵陽鐵化合物峰的產品質理數，從根本上由母核機構的特色描述皮膚靈魂濃縮的魔能石陽鐵化合物峰判定該酚類化合物是含羧酸的行成物（一些酚類化合物在該狀況下不行成行成化，馥郁酸行成化成品率很低，該狀況下僅為直鏈蛋白質的酸的10%上下）。將氧碳共價鍵陽鐵化合物的產品質理數m/z [MH]+ 代入工式 (1) 或工式 (2)～(7)確定查驗，所榮獲的碳共價鍵數n所需具備整結果。在這基礎條件上追尋質譜圖上體現 的氧碳共價鍵陽鐵化合物峰經裂解后行成的失水皮膚靈魂濃縮的魔能石峰[MH]+-H2O, 并就此判定能不為飽滿狀態狀態又也許不飽滿狀態狀態蛋白質的酸。判別為不飽滿狀態狀態蛋白質的酸后，只能根據核算所榮獲的不飽滿狀態狀態蛋白質的酸的雙鍵數額后，在質譜圖上追尋只能根據數額的特色描述皮膚靈魂濃縮的魔能石陽鐵化合物峰的產品質理數（對含單雙鍵的蛋白質的酸，使用于1一款政府部門產品質理差愈來愈簡易 ；對多不飽滿狀態狀態的蛋白質的酸，使用40個產品質理差的機構摸塊非常為本要）。

　　圖  5  以5,8,11,14,17三十碳五烯酸為體現的不達到飽和狀態皮脂酸延伸物的質譜裂解關心圖(略)

　　Fig.5  Ｐrofile of ion current chromatogram and scanning of the isolated representative derivative of 5, 8, 11, 14, 17eicosapentaenoic acid (C20∶5) with BDEＢS as labeling reagent

　　Ａ． ＭＳ； Ｂ，Ｃ，Ｄ： ＭＳ／ＭＳ．

　　3.2  具象化要求調整及魚油原輔料分割1,2苯并3,4二氫咔唑9乙基苯磺酸酯與碳水化合物酸的具象化化隨相轉移催化體現發應劑有差異于具象化化成品率有更為明顯異同。檢測中別摘取苯、甲苯、乙腈、N,N二甲基甲酰胺(DMF，空氣晾干后緩解壓力方法水蒸氣萃取加工辦理) 、四氫呋喃、二甲亞砜(DMSO，空氣晾干后緩解壓力方法水蒸氣萃取加工辦理)身為相轉移催化體現發應劑標準，以C16∶0、C17∶0、C18∶1、C22∶0和C20∶4長鏈飽滿及不飽滿碳水化合物酸為代表會，調研學習了具象化化成品率。既然DMSO具備有和DMF相對的具象化功效，那么以DMSO為相轉移催化體現發應劑中應領取的具象化物在色譜過柱操作過程中致使較多的干攏峰（副癥狀有機物多），檢測中摘取DMF作具象化化相轉移催化體現發應劑。磺酸酯與碳水化合物酸的具象化化隨咸性催化體現發應劑的有差異于，癥狀成品率有差異于，檢測中摘取K2CO3、K2C2O4、Na2CO3、KAc和檸檬汁酸鉀等這幾種咸性催化體現發應劑，對具象化化成品率確定了調研學習，最終結果意味著：K2CO3和Na2CO3具備有最多的具象化成品率。決定到K2CO3在DMF中具備有極大的融掉力，故檢測摘取K2CO3。既然具象化化成品率隨K2CO3需求量的提升而上升，但過高的需求量會致使微生物培養基的部位分解掉。檢測中摘取K2CO3的需求量為10 mg (需求量約為具象化化微生物培養基需求量的30～40倍，按磨爾量換算)。對具象化化溫表的調研學習意味著：具象化化成品率隨溫表變高而上升，高出95℃后，在副癥狀的發生具象化化成品率繼而縮減，檢測數中擇具象化溫表為85℃，具象化化時45 min。按上述情況具象化要求，經LC分割的色譜圖見圖6。領取的LC/MS/APCI總鋁離子流見圖7。質譜數據信息詳解最終結果列于表1。由表1由此可見，深海圖片魚油常見由C12C22的飽滿及不飽滿碳水化合物酸成分，分割后不飽滿碳水化合物酸的分量占67.08% （峰綠地面積歸一化以15到45 min內外流的各混合物確定換算）。 在當中C16∶19第十五碳烯酸 (117%); C16∶44, 7, 10, 13第十五碳四烯酸 (2.91%); C18∶112 18碳烯酸 (11.1%); C18∶46, 9, 12, 15 18碳四烯酸 (3.62%); C20∶113二十五五碳烯酸 (1.21%); C20∶55, 8, 11, 14, 17二十五五碳五烯酸 (1671%); C22∶62, 5, 8, 11, 14, 17二十五五二碳六烯酸 (10.53%) 等不飽滿長鏈碳水化合物酸是魚油的常見混合物。

　　圖6  海洋魚動物油脂肪酸的色譜破乳圖 (峰標明見表1)(略)

　　Fig.6  Chromatogram of longchain fatty acid derivatives from deepsea fish oil (peaks as in Table 1)

　　圖7  深海圖片魚油備樣質譜陽離子流圖 (峰標出見表1)(略)

　　Fig.7  MS ion chromatogram of the isolated fatty acid derivatives from deepsea fish oil (peaks as in Table 1)

　　表1  深海中魚油中皮脂酸繁衍物的質譜辨析數據庫(略)

　　Table 1  MS analysis of the fatty acid derivatives from deepsea fish oil sample

　　References

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　　6  Zou Yaohong(鄒耀洪). Chinese J． Anal． Chem．(分析一下化學工業), 2004, 32(1): 71～75

　　這篇文章系國家的自燃科學的基金投資捐資助學好項目（No. 20075016）

　　(曲阜師范學校物理生物學技術學院，曲阜 273165)

　　(我們小學科工程學院東北髙原生態學探索所，西寧 810001)