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您所在的位置：首頁 > （RPHPLC）與質譜（MS）聯用技術對固相法化學合成七肽（H2NPFNSLAICOOH，Mr 760.9）時出現的消旋產物進行了分析。根據弱疏水性合成七肽粗品特性，提出了充分利用吸附和分配雙重保留機制的“早期吸附”概念，以此優化色譜條件得到4個峰形良好的色譜峰；質譜分析表明：4譜峰具有相同的m/z 761.5 [M＋H]+值，對每一消旋產物進行在線多肽測序，并利用串聯質譜（MSn）譜圖疊加的方法，得到b軸和y軸兩套片段信息，成功確定了合成七肽的4個消旋產物。

　　關鍵詞  高效液相色譜質譜，固相多肽合成，消旋，多肽測序

　　1  引言

　　196幾年Merrifield建立了固相多肽分解，用簡潔明了的洗衣運行辦法取代了了特別分解方式辦法中的分離處理、重心得、板層和柱層等純化運行辦法，其領先性使該辦法多應用在幾種基本模式多肽和先天多肽的光催化原理。但服務消旋是分解中絕大多數發生的不良現象，即原材料氨基為L型（或D型），而服務中一些氨基殘基會變化為D型（或L型）[1]，因而影響力終服務飽和度與產出率。所以，放到消旋化變為多肽分解中同一個三十分極為重要的間題，而消旋服務的判斷與具體分析是在當中的主要。 　　RPHPLC更具不高的判別率，已寬泛APP于多肽和蛋清的分開處理。根據多肽在疏水性樹脂放置相漆層上的粘附與解吸這不僅衡量于有機酸編碼字段，且各自余地架構業內，即“疏水腳”的微細有什么區別將使構象與眾不一的多肽更具與眾不一的色譜抹去活動[2]。為此，RPHPLC可以效分開處理編碼字段可以說截然一樣的的多肽及多肽的消旋化貨物[ 3～5]。 　　本研發對確定HBTU/Fmoc固相法[6]無機化學煉制圖片弱疏丙烯酸乳液七肽（H2NPFNSLAICOOH）時導致的消旋物品確定了RPHPLC/MS具體數據分析：依據適用人群于區別的分開關鍵字的塔板原理[7]、Onoff原理[8]和的計量置換原理[9]等原有RPHPLC恢復生理機制，據弱疏丙烯酸乳液多肽基本特性 ，說出“前面吸附物”構架，并經色譜水平改善，贏得了峰形充分的譜峰。根據將區別的MSn水平下獲得的陰離子殘片和豐度信息內容確定暫時性增加[10]，控制了對每多肽的一級測序，因此取得成功具體數據分析了煉制圖片七肽的4個消旋物品，為消旋化測試帶來一堆種新形式。

　　2  實驗部分

　　2.1  議器和微生物培養基 　　有效率液質色譜系統(青島依利特數據統計分析實驗室設備有效集團),涉及P200Ⅱ型髙壓恒流泵、UV200ⅡUV紫外線可變氣門正時吸光度探測器和Echrom98色譜上班站。氣相色譜柱：Lichrosorb RP18, 比表面積5 μm, 活性炭過濾器鉆孔大小10 nm, 200 mm×4.6 mm（新加坡惠普集團）；Lichrospher 100 C18, 比表面積5 μm, 活性炭過濾器鉆孔大小10 nm, 250 mm×4 mm（國外Merck集團）;液/質聯用儀：電噴霧化合物阱質譜LCQ Advantage MAX，Bioworks 3.0數據統計解決電腦軟件（新加坡Thermo Finnigan集團）。七肽按文章[11]所采用固相法簡單手工合并；乙腈（色譜純，國外Merck集團）；三氟乙酸（TFA）（色譜純，迪馬集團）；超純凈水（手工制作）。 　　2.2  色譜生活條件 　　流通相：A液：水（0.1％TFA）；B液：乙腈（0.1％TFA）。最優投資組合均值洗刷經營模式：0→10 min，B液0→7%；10→14 min，B液7％→30%；14→48 min，B液30％→50%。柱溫：環境溫度；流體密度：0.7 mL/min；測量主波長214 nm；圖紙用60%乙腈/水融掉，密度5 g/L；進樣量20 μL。 　　2.3  質譜數據分析 　　色譜前提條件同上。電保濕噴霧電離（ESI），正亞鐵離子檢查，磕碰氣為氦氣，做做霧化氣（N2）流動速度5 μＬ/min，源溫200℃，做做霧化水壓0.345 MPa；打印儀打印比率：50～2000 m/z。首先次質譜分折用全打印儀打印，以才能得到一個色譜峰確切且一種的m/z值，緊接著的質譜分折中修改比磕碰正能量等叁數以才能得到一系例MS2圖譜來成功完成多肽測序，用Bioworks 3.0軟件分折英雄碎片資訊，按學術論文[10]的方式做出譜圖的疊合介紹。

　　3  結果與討論

　　3.1  人工七肽粗品的質譜進行進樣數據分析 　　對轉化成七肽粗品用質譜滴注泵之間進樣采取全掃描拍照介紹，得以多元化的m/z 761.5 [M＋H]+ 峰，與總體目標多肽原子量760.9貼合，反映轉化成代謝物含量很高，從未轉成大量的斷頭肽和空腔肽同類的溶物。   　　3.2  鑲嵌七肽粗品的RPHPLC分折

　　3.2.1  弱疏水性多肽RPHPLC保留行為解析  RPHPLC中溶質保留機理的預測一直是色譜理論研究的熱點，迄今為止提出的模型多達10余種，應用較多的主要有：適用于小分子物質的塔板理論[7]、Snyder經驗公式、溶解度參數模型、溶劑色效模型、疏溶劑化模型等[8]；而對于生物大分子而言，Onoff模型[9]、尤其是耿信篤提出的計量置換保留理論（SDTR）是目前公認的保留機理[8]。
  
　　基于吸附機制提出的Onoff模型認為：在多肽及蛋白質的RPHPLC分析中，初始洗脫條件下有機改性劑濃度較低，溶質分子與固定相之間的疏水作用較強，幾乎完全吸附，“停滯”不動。而一旦洗脫液中有機改性劑（或稱為強溶劑、置換劑等）達到臨界濃度，使得多肽或蛋白質與流動相間的作用大于其與固定相的作用，則溶質“瞬時”解吸到流動相，并形成尖銳的洗脫峰，此后溶質與固定相無任何作用。這一理論對于疏水性很強的蛋白質和多肽等大分子物質是適用的。

　　針對調查中合出的弱疏水溶性七肽（親疏水溶性值按論文資料[12]工藝計算公式為－6.1），本研發提到可將液相離子交換柱前后輪劃分為吸咐段a和安排比例段b兩端，并我認為溶質的色譜開展行為舉動是吸咐和安排比例倆種策略的標準化。缺省過柱要求下有機質有效改善劑鹽溶度較低，溶質被截然吸咐于a段，為吸咐策略把控好；當過柱液中含機質有效改善劑可達臨界點鹽溶度，多肽被瞬時過柱后，未必像“Onoff”理論上上述溶質與比較緊固相兩者間再無任意原因，而且在b段仍全是定用，為安排比例策略所把控好。要加大安排比例策略在b段的榮譽獎度，可獲取“旱期吸咐”時，就是將缺省過柱液中含機質有效改善劑鹽溶度設為非常低值，并保持穩定這段事件（約10 min）。于此，是因為的流動相稀釋劑與被分開法多肽兩者間的用勁兒源源不斷不低于比較緊固相與多肽兩者間的用勁兒，則樣品管理在校園營銷推廣活動初期可以了便捷而截然地吸咐于比較緊固相上。故此前端的吸咐段a突出提升；又是因為每根液相離子交換柱柱長需，a段提升相較提升了后段安排比例段b的長寬高，故此，可實現了加大b段中安排比例策略榮譽獎度的目的性。下圖１如圖，當獲取“旱期吸咐”后，分開法度能夠得到有效改善；于己，當割舍“旱期吸咐”時，則溶質暫未更加充分吸咐即被便捷過柱，因此 出峰非常早、分開法度差有（圖２）。  　　圖１  機遇“晚期降解”分解七肽的色譜圖（略） 　　Fig.１  Chromatogram of heptapeptide with preadsorption

　　B%為流動相中B液的體積分數（B% is the volume fraction of solution B in mobile phase)。
　　
　　在相同洗脫條件下，使用３支不同塔板數的C18色譜柱分析該七肽。如果按Onoff理論所述單純由吸附控制，則分離度與塔板數無關，應得到相同的譜圖。但實驗結果卻發現，分離度有一定差異（圖３），說明b段的分配機制對分離效果確有影響。綜合考慮a、b兩段，可以證明：弱疏水性小肽的RPHPLC保留行為不同于疏水性蛋白，是分配和吸附雙重機制共同作用的結果。
 
　　圖2  舍棄“早期吸附”的合成七肽色譜圖（略）

　　Fig.2  Chromatogram of heptapeptide without preadsorption 　　B%為流量相中B液的表面積得分(B% is the volume fraction of solution B in mobile phase)。  　　圖３  ３支不同于塔板數的C18氣相色譜柱進行分析（略） 　　Fig.３  Analysis using three C18 chromatographic columns with different plate numbers

　　1. Lichrosorb RP18（10 μm, 10 nm, 200 mm×4.6 mm） 塔板數(plate numbers)=6000; 2. Lichrosorb RP18（5 μm, 10 nm, 200 mm×4.6 mm） 塔板數(plate numbers)=12000; 3. Lichrospher100 C18（5 μm, 10 nm, 250 mm×4 mm） 塔板數 (plate numbers)=15000。
　　3.2.2  RPHPLC分析條件優化  首先用純乙腈和純水組成的梯度洗脫體系分析合成七肽粗品（圖４A），峰1（圖中標識）未得到理想分離；隨后不斷降低梯度斜率，以使峰1與其它譜峰分開，得到一系列色譜圖（圖４B、４C、４D）。由圖可知：隨著梯度斜率的緩慢降低，分離度得到改善，但峰形逐漸變鈍，并發生托尾。這說明疏水性蛋白和多肽對有機改性劑的變化較為敏感[13]；相反弱疏水性小肽（即本文所合成七肽的消旋產物，對應于圖４中各譜峰）則反應“遲鈍”。即將后者從固定相上洗脫所需溶劑突越范圍較寬[14]，改變梯度斜率對其影響相對較小。所以，當梯度斜率降至一定程度時，只有改變其它色譜條件方能得到理想峰形。

　　圖4  多種系數情況下的合成視頻七肽（弱疏丙烯酸乳液肽）色譜圖（略） 　　Fig.4  Chromatograms of heptapeptides (i.e. weak hydrophobic peptides) at different gradient elution conditions 　　B%為移動相中B液的容積考試分數(lichrospher100 C18, 5 μm, 10 nm, 250 mm×4 mm; B% is the volume fraction of solution B in mobile phase)。 　　在純凈水相里添加入0.1%的TFA，如同５圖甲中（沖洗掉模式，見2.2），分離出來的效果理想型，共獲取4個譜峰。據3.1質譜進行進樣數據分析結果，進行證明文件4個譜峰相關聯于七肽的4個消旋化合物。 　　3.3  液質聯用對合成視頻七肽消旋乙酰乙酸的測序分析一下 　　先是適用LC/ESI/MS對圖５中的4個譜峰展開全掃錨，遇到4個譜峰的m/z均為761.5；其次展開二、次實驗所，選用LC/ESI/MS2對每項譜峰展開同屏在線多肽測序，采用變更對結合人體脂肪６０、３８和２５ eV，獲得充足的魂晶的信息。最終顯示：4種化合物的原子核量和編碼序列基本如此，是組成七肽的4個消旋化合物，由分布組裝介紹就能夠推測是肽鏈上的幾個酪氨酸殘基進行了消旋[15]。 　　在來做出MS2測序時，沒能在與眾不同質譜因素下得了了到其他靈魂皮膚碎片個人信息。與眾不同因素下得了了到的圖譜在靈魂皮膚碎片化合物峰的什么和無線信號快慢的生長城市等幾個方面享有某種的相容性，能夠 有使用地將譜圖疊合起床來做出闡述，于是到簡易并聯質譜研究分析和不斷提高多肽測序準確度性的為的[10]。圖６為五級質譜闡述中結合七肽的b軸和y軸情節個人信息，據此選擇了結合七肽的4個消旋物質。  　　圖５  鑲嵌七肽合適色譜圖（略） 　　Fig.５  Optimized chromatogram of heptapeptide  　　圖６  譜圖堆砌后的分解七肽MS2剖析（略） 　　Fig.６  MS2 analysis of heptapeptide by spectrum superposition 　　Ａ．制作而成七肽b軸與y軸損傷震碎的碎片圖示圖(b and y fragment ions of synthsized heptapepetide); B. 制作而成七肽MS2譜圖(MS2 spectrum of synthesized heptapepetide)。 　　3.4  個人心得體會 　　本研發對使用HBTU/Fmoc固相法化學上的自動自動制成弱疏水溶性七肽（H2NPFNSLAICOOH）時導致的消旋后果開始了RPHPLC/MS淺析：（1）談話了弱疏水溶性七肽在RPHPLC中提取差向異構的特種性，特征提取塔板實際與實踐知識、onoff實際與實踐知識和量值溯源置換實際與實踐知識提出者了“前期吸”說法，以優化網絡色譜必備先決條件可做好使用左右和吸兩種提取新機制來促進剝離 成效，并結果是得見4個峰形穩定的色譜峰；（2）質譜可以直接進樣淺析得出結論：4譜峰兼具一樣的的m/z 761.5 [M＋H]+ 值，與最終目標多肽大分子量760.9接觸，分別于自動自動制成七肽的4種消旋代謝物；（3）對每一項譜峰開始在線免費多肽測序，將不一樣MS2必備先決條件下的化合物魂晶和豐度產品資料開始首選性制成，得見b軸和y軸的魂晶產品資料，完美地淺析了自動自動制成七肽的4個消旋代謝物。

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　　（天津天士力集團，天津 ３００４０２）